Rot und Blau markierte Proteine lassen Zellen gelb leuchten: Zum ersten Mal können Protein-Interaktionen und die jeweiligen Reaktionspartner gleichzeitig nachgewiesen werden
Viele Proteine (Eiweiße) wirken in der Zelle als Botenstoff, indem sie miteinander interagieren und so die zellulären Abläufe steuern. Zu untersuchen, ob und wie bestimmte Proteine interagieren, ist deshalb wichtig für ein besseres Verständnis der Zellfunktionen. Wissenschaftler des GSF - Forschungszentrums für Umwelt und Gesundheit entwickelten nun eine Methode, mit der in lebenden Zellen sowohl die Interaktion an sich, als auch die beteiligten Reaktionspartner durch fluoreszierende Farben sichtbar gemacht werden können.
Den entscheidenden Vorteil des neuen Ansatzes erläutert Dr. Ruth Brack-Werner, die Leiterin des GSF-Instituts für Molekulare Virologie (IMV): "Wenn es kein Signal für eine Interaktion gibt, konnte man bisher nicht unterscheiden, ob wirklich keine Interaktion stattfindet oder ob ein Reaktionspartner gar nicht gebildet wird." Brack-Werner entwickelte deshalb die sogenannte extended bimolecular fluorescence complementation (exBiFC) - ein System, bei dem angezeigt wird, ob auch alle beteiligten Proteine vorhanden sind.
Der Hauptfokus der Forschung Brack-Werners und ihrer Mitarbeiter liegt auf der Identifizierung zellulärer Mechanismen, die die Vermehrung des AIDS verursachenden HI-Virus beeinflussen. "Um diese Mechanismen aufzuklären, müssen wir untersuchen, wie zelluläre und HIV-regulatorische Proteine interagieren", erklärt Brack-Werner. Vor diesem Hintergrund entwickelten und validierten die Wissenschaftler exBiFC am Beispiel des HIV-Proteins Rev, das ein wichtiger Schlüsselfaktor für die HIV-Vermehrung ist. Damit sich das HI-Virus vermehren kann, müssen Rev-Proteine miteinander interagieren, zudem geht Rev auch eine Interaktion mit verschiedenen zellulären Proteinen ein. Rev vermittelt den Transport von HIV-Nukleinsäuren (mRNA) aus dem Zellkern in das Zytoplasma, die dort für die Bildung neuer Viruspartikel gebraucht werden.
Durch exBiFC lassen sich diese HIV-Proteine und ihre Interaktionen in der Zelle durch verschiedene fluoreszierende Farben nachweisen. Der Trick dabei: Jeder potentielle Interaktionspartner ist Bestandteil eines Fusionsproteins, das rot bzw. blau leuchtet und zusätzlich noch eine Hälfte eines gelb fluoreszierenden Proteins enthält.
Werden artifizielle Gene für diese Fusionsproteine in Zellen eingeschleust, zeigt die rote bzw. blaue Fluoreszenz die Bildung der Interaktionspartner an. Wenn die beiden Partner miteinander interagieren, kommt es zu einer zusätzlichen gelben Fluoreszenz, da die beiden Hälften des gelb fluoreszierenden Proteins sich zu einem gelb leuchtenden Protein ergänzen.
Mit diesem Verfahren wies die Arbeitsgruppe um Brack-Werner die Interaktion von Rev mit sich selber und mit zwei zellulären Proteinen (Risp, Exportin 1) in lebenden Zellen nach. "ExBIFC funktioniert also sehr gut und ist eine wertvolle Hilfe, die Ergebnisse anderer Methoden in der lebenden Zelle zu bestätigen", erklärt Brack-Werner, "zudem hat exBiFC den großen Vorteil, dass das Signal für die Interaktion nicht davon abhängt, dass die Reaktionspartner in bestimmte Zellkompartimente - z.B. den Zellkern - gelangen".
Mit exBiFC steht den Wissenschaftlern nun ein elegantes Werkzeug zur Verfügung, um nach weiteren Interaktionspartnern für regulatorische HIV-Proteine zu suchen. Da es auch Interaktionen gibt, die Rev inhibieren, können mit Hilfe von exBiFC Faktoren gesucht werden, die die HIV-Vermehrung verhindern. "ExBiFC erlaubt uns nie zuvor gesehene Einsichten in Protein-Interaktionen in der lebenden Zelle, dies hat auch ein enormes Potential für die Entwicklung neuer Anti-HIV-Strategien", betont Brack-Werner.
Originalveröffentlichung: Wolff H, Hartl A, Eilken HM, Hadian K, Ziegler M, Brack-Werner R. Live-cell assay for simultaneous monitoring of expression and interaction of proteins. BioTechniques 41: 688-692 (2006)
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Neuherberg, 12. Februar 2007
